Validação in vitro e in vivo da viabilidade de eritrócitos suínos estocados para estabelecer um modelo experimental de transfusão homóloga de hemácias: estudo piloto / In vitro and in vivo validation of stored swine erythrocyte viability to establish an experimental model of homologous red blood cell transfusion: a pilot study

Objetivo: Para desenvolver modelos experimentais de transfusão de hemácias, o primeiro passo é assegurar a viabilidade dos eritrócitos transfundidos. Avaliamos a viabilidade de eritrócitos transfundidos com validação in vitro e in vivo de eritrócitos suínos homólogos armazenados por 14 dias. Métodos: Neste estudo piloto, o sangue coletado de um suíno Agroceres® foi estocado em duas unidades de hemácias. A validação in vivo foi realizada pela marcação dos eritrócitos com Na2 51CrO4 e recuperação dos eritrócitos viáveis após 24 horas da infusão em um animal autólogo e quatro homólogos. A validação in vitro foi realizada na avaliação basal e após 14 dias, pela mensuração da hemoglobina, hematócrito, índice de hemólise e hemoglobina livre em seis unidades de hemácias. Foi realizada uma esplenectomia post-mortem para avaliar o sequestro esplênico de eritrócitos, e a radioatividade das amostras de sobrenadante foi contada para avaliar a hemólise intravascular. Resultados: Após 14 dias de estocagem, as unidades de hemácias tinham volumes menores e concentração total de hemoglobina equivalente em comparação aos padrões humanos. A concentração de hemoglobina livre aumentou de 31,0±9,3 para 112,4±31,4mg/dL (p<0,001) e o índice de hemólise aumentou de 0,1±0,1 para 0,5±0,1% (p<0,001). Entretanto, esses testes se encontravam dentro da faixa aceitável para os padrões humanos. A percentagem de radioatividade nas amostras de sobrenadante foi similar na avaliação basal e após 24 horas, afastando, assim, a presença de hemólise significante. Não se encontraram evidências de sequestro esplênico de eritrócitos radioativos. ...

Objective: To develop experimental models of erythrocyte transfusion, the first step is to ensure the viability of the red blood cells transfused. In this pilot study, we assessed the viability of transfused red blood cells with validation in vitro and in vivo of homologous swine erythrocytes stored for 14 days. Methods: Blood collected from one Agroceres® swine was stored in two red blood cell units. In vivo validation was performed by labeling the red blood cells with Na2 51CrO4 and recovering the viable erythrocytes after 24 hours of infusion in one autologous and four homologous animals. In vitro validation was performed at baseline and after 14 days in sixteen red blood cell units by measuring hemoglobin, hematocrit, hemolysis index and free hemoglobin. A post-mortem splenectomy was performed to evaluate the splenic sequestration of erythrocytes, and the radioactivity of the supernatant samples was counted to evaluate intravascular hemolysis. Results: After 14 days of storage, the red blood cell units had lower volumes and equivalent total concentrations of hemoglobin and hematocrit compared to human standards. The free hemoglobin concentration increased from 31.0±9.3 to 112.4±31.4mg/dL (p<0.001), and the hemolysis index increased from 0.1±0.1 to 0.5±0.1% (p<0.001). However, these tests were within the acceptable range for human standards. The percentage of radioactivity in supernatant samples was similar at baseline and after 24 hours, thus excluding significant hemolysis. No evidence of splenic sequestration of radioactive erythrocytes was found. Conclusion: Swine red blood cells stored for 14 days are viable and can be used in experimental studies of transfusion. These validation experiments are important to aid investigators in establishing experimental models of transfusion. .

Introdução do NAT no Brazil: algumas considerações adicionais: [carta ao editor] / NAT application in Brazil: some additional aspects to be considered: [letter to the editor]

The authors comment on a recent letter to the Editor which dealtwith the introduction of NAT in Brazil.

Dengue em doadores de sangue: necessitamos de triagem laboratorial no Brasil?: [carta ao editor] / Dengue in blood donors: do we need laboratorial screening?: [letter to editor]

Over the last 20 years, dengue has re-emerged in Brazil causing successive outbreaks with thousands of cases of dengue fever and hundreds of deaths. Similar to other Flaviviruses, the majority of the infections are asymptomatic. This can potentially lead to the collection of blood from a viremic donor, raising the possibilitiy of transfusional dengue. However, the paucity of such cases strongly contrasts to the number of cases observed globally. Dr. Estácio Ramos has advocated the urgent introduction of laboratorial screening of blood donations by use of an antigenic test in ELISA format (NSI). We would rather suggest more caution in postulating a mesure that may cause an uçndersirable impact on the cost and availability of blood in our country. We believe that a cost-benefit analysis, based on solid scientific data, is mandatory before any specific measure is adopted. Towards that end, we are performing a survey of dengue RNA among blood donors from six Brazilian cities (Rio de Janeiro, São Paulo, Ribeirão Preto, Goiânia, Fortaleza and Campo Grande) collec ted during the epidemic season (March-May, 2008) which may foster this discussion. Rev.Bras.Hematol.Hematoter. 2008, 30(5):417-418.

Replacement of HIV p24 Ag test by a multiplex RT-PCR method for primary screening of blood donors

Nucleic Acid Testing (NAT) as a tool for primary screening of blood donors became a reality in the end of the 1990 decade. We report here the development of an "in-house" RT-PCR method that allows the simultaneous (multiplex) detection of HCV and HIV-RNA in addition to an artificial RNA employed as an external control. This method detects all HIV group M subtypes, plus group N and O, with a detection threshold of 500 IU/mL. After validation, the method replaced p24 Ag testing, in use for blood donation screening since 1996 at our services. From July 2001 to February 2006, 102,469 donations were tested and 41 (0.04 percent) were found HIV-RNA reactive. One NAT-only reactive donation (antibody non-reactive) was observed, with subsequent seroconversion of the implied donor, giving a yield of 1:102,469. This rate is in contrast to the international experience that reports a detection of approximately 1:600,000 - 1:3,100,000 of isolated HIV-RNA donations.

O uso de testes de ácidos nucleicos (NAT) na rotina de triagem de doadores de sangue tornou-se uma realidade ao final da década de 1990. Descreve-se aqui uma metodologia de RT-PCR multiplex "in-house" que permite a detecção simultânea dos RNAs dos vírus HIV e HCV além de uma molécula artificial de RNA usada como controle externo. O método detecta todos os subtipos de HIV do grupo M e também do grupo N e O, com uma sensibilidade de 500 UI/mL. Após validação, este teste substituiu o do antígeno p24, até então na rotina de triagem em nosso laboratório, desde 1996. De julho de 2001 a fevereiro de 2006 foram testadas 102.469 doações e 41 (0.04 por cento) foram NAT reativas. Uma doação NAT isoladamente reativa (anticorpo não-reativa) foi detectada com soroconversão subseqüente do doador, portanto, o rendimento do NAT nesta população até o presente momento é de 1:102.469. Este número contrasta com a experiência obtida internacionalmente, onde taxas de 1:600.000 - 1:3.100.000 foram descritas.

Primary screening of blood donors by nat testing for HCV-RNA: development of an "in-house" method and results

An "in-house" RT-PCR method was developed that allows the simultaneous detection of the RNA of the Hepatitis C Virus (HCV) and an artificial RNA employed as an external control. Samples were analyzed in pools of 6-12 donations, each donation included in two pools, one horizontal and one vertical, permitting the immediate identification of a reactive donation, obviating the need for pool dismembering. The whole process took 6-8 hours per day and results were issued in parallel to serology. The method was shown to detect all six HCV genotypes and a sensitivity of 500 IU/mL was achieved (95 percent hit rate). Until July 2005, 139,678 donations were tested and 315 (0.23 percent) were found reactive for HCV-RNA. Except for five false-positives, all 310 presented the corresponding antibody as well, so the yield of NAT-only donations was zero, presenting a specificity of 99.83 percent. Detection of a window period donation, in the population studied, will probably demand testing of a larger number of donations. International experience is showing a rate of 1:200,000 - 1:500,000 of isolated HCV-RNA reactive donations.

Desenvolveu-se uma metodologia própria ("in-house") baseada em RT-PCR, que permite detectar simultaneamente o RNA do vírus HCV e de um RNA artificial empregado como controle externo. As amostras são analisadas em pools de 6-12 doações, cada doação sendo incluída em dois pools diferentes, um horizontal e um vertical, permitindo a identificação imediata de uma doação reativa, sem a necessidade de desmembrar-se um pool reativo. O processo todo consumiu de 6-8 horas diárias e os resultados foram emitidos em paralelo à sorologia. O método detectou os seis genótipos de HCV, com um limite de sensibilidade de 500 UI/mL (95 por cento hit rate). Até julho de 2005 haviam sido testadas 139.678 doações com a detecção de 315 (0,23 por cento) doações reativas para HCV-RNA. Exceto cinco falso-positivas, todas estas doações também apresentavam o respectivo anticorpo, portanto não se detectou nenhuma doação em janela imunológica. A especificidade foi de 99,83 por cento. A detecção de amostra em janela imunológica, nesta população de doadores, provavelmente demandará a análise de um número maior de doações, espelhando-se na experiência internacional que tem mostrado a detecção de amostras HCV-RNA isoladas em 1:200.000 - 1:500.000 doações.

A case report of neonatal alloimmune thrombocytopenic purpura: the importance of correct diagnosis for future pregnancies

CONTEXTO: Púrpura trombocitopênica neonatal aloimune (PTNA) é uma doença neonatal caracterizada por aloimunização materna contra as plaquetas fetais, que apresentam antígenos herdados do pai. Podem ocorrer hemorragias cerebrais, levando à morte ou a anomalias neurológicas permanentes. RELATO DE CASO: Mulher saudável, de 30 anos, deu à luz, por parto cesariano na 36ª semana de gestação, seu primeiro filho. Com 10 horas de vida, o recém-nascido apresentou petéquias e contagem de 8 x 103 plaquetas/µl no sangue periférico; foi medicado com imunoglobulina e recebeu alta após 18 dias de internação, com 100 x 103 plaquetas/µl. A causa da trombocitopenia não foi elucidada na época. Um ano depois, a criança morreu de neuroblastoma. Como os pais desejavam outro filho, foram encaminhados para investigação da trombocitopenia. Genotipagem plaquetária e pesquisa de anticorpos antiplaquetários foram realizadas, mostrando total falta de concordância entre os sistemas HPA-1 do pai (HPA-1a1a) e da mãe (HPA-1b1b) e anticorpos anti-HPA-1a no soro da mãe. Concluímos que o primeiro bebê nasceu com PTNA. Por isso, na segunda gravidez, a mãe foi tratada com diversas infusões de imunoglobulina intravenosa. Foi realizado cuidadoso monitoramento por ultra-som, com resultados normais para mãe e feto durante a gravidez. O segundo bebê nasceu por cesárea às 39 semanas, apresentando 92 x 103 plaquetas/µl seis horas após o nascimento. As plaquetas do recém-nascido foram genotipadas como HPA-1a1b e o soro da mãe novamente mostrou anticorpos anti-HPA-1a. Não houve hemorragia. A terapia de infusão de imunoglobulina foi efetiva na prevenção da PTNA no segundo filho.

Risco residual da transmissão da infecção por Trypanosoma cruzi por via transfusional no Brasil / Residual risk for Trypanosoma cruzi transmision by transfusions in Brazil

Para avaliação da existência do risco residual transfusional da infecção por Trypanosoma cruzi no Brasil, dados referentes a 601 serviços responsáveis por coleta de sangue foram obtidos, assim como um painel nacional oriundo de 13.383 doadores. Estes soros foram analisados frente a uma série de provas utilizadas como triagem, assim como algumas de referência. Os resultados demonstram uma distribuição espacial do risco transfusional, estimando-se um valor entre 0,9 a 7,4 casos para cada 100.000 bolsas colhidas de sangue total apresentando resultados falso negativos, dos quais 0,44 a 2,75:100.000 componentes produzidos podem resultar em infecção aos receptores / In order to evaluate the transfusional residual risk by Trypanosoma cruzi in Brazil, a survey from 601 Blood Transfusion Services responsible for whole blood collection and a national panel from 13,383 blood donors was analysed. These blood samples were tested against a number of screening tests, and additionaly evaluated by reference methods. The results demonstrate a spatial distribution over the country, with the estimated false negative rate ranging from 0.9 to 7.4 cases per 100,000 whole blood units, leading to 0.44 to 2.75:100,000 components that might actually transmit infection to recipients...

Determinaçäo pré-natal do sexo fetal por meio da análise de DNA no plasma materno / Prenatal fetal gender determination by the analysis of DNA from maternal plasma

Objetivo: avaliar um novo método de determinaçäo do sexo fetal pela análise de DNA obtido do plasma materno. Métodos: sangue periférico (10 mL) foi coletado de mulheres grávidas em diferentes idades gestacionais. O plasma foi separado e o DNA isolado do mesmo foi submetido à reaçäo em cadeia da polimerase (PCR) com oligonucleotídeos iniciadores derivados do gene DYS14 específico do cromossomo Y. Resultados: foram analisadas amostras de 212 pacientes. O resultado da PCR foi comparado ao sexo determinado pela ultra-sonografia e/ou do nascimento. Houve concordância em 209 das 212 pacientes. Nos 3 casos discordantes a PCR apontou resultado feminino, sendo as três amostras coletadas antes da 8ª semana de gravidez. Conclusäo: o método de PCR desenvolvido para a determinaçäo do sexo fetal possui excelente sensibilidade e especificidade, permitindo seu uso rotineiro. O resultado de sexo masculino possui maior confiabilidade que o feminino, principalmente em idade gestacional precoce. Novas aplicações para o DNA fetal no plasma materno estäo sendo pesquisadas, permitindo no futuro o diagnóstico näo invasivo de uma série de doenças

High prevalence of GB Virus C/Hepatitis G Virus RNA among Brazilian blood donors

The aim of this study was to investigate the presence of the Hepatitis G Virus on a population of blood donors from São Paulo, Brazil and to evaluate its association to sociodemographic variables. Two RT-PCR systems targeting the putative 5'NCR and NS3 regions were employed and the former has shown a higher sensitivity. The observed prevalence of HGV-RNA on 545 blood donors was 9.7 percent (CI 95 percent 7.4;12.5). Statistical analysis depicted an association with race/ethnicity, black and mulatto donors being more frequently infected; and also with years of education, less educated donors presenting higher prevalences. No association was observed with other sociodemographic parameters as age, gender, place of birth and of residence. DNA sequencing of nine randomly chosen isolates demonstrated the presence of genotypes 1, 2 and 3 among our population but clustering of these Brazilian isolates was not detected upon phylogenetic analysis

HCV-RNA PCR as a screening test on blood donors pools

O objetivo desse trabalho foi investigar o uso da reaçäo em cadeia da polimerase como um teste auxiliar para o vírus da hepatite C. Nós testamos 1800consecutivas doaçöes de sangue estocada de doadores voluntários de Säo Paulo, Brasil. Trinta e seis "pools" de 50 amostras (2ul cadaforam submetidos a amplificaçäo pela reaçäo em cadeia da polimerase por meio do sistema amplicor HCV (Roche). Reatividade em uma reaçäo por ummunoblot (RIBA 3.0, Ortho Diagnostics) foi considerada "gold standard". A reaçäo em cadeia da polimerase apresentou uma sensibilidade de 66 por cento e especificidade superior a 99,9 por cento. ELISA mostrou uma especificidade de 99,44 por cento. Três "pools" contendo pelo menos um ELISA positivo RIBA confimou uma amostra apresentando um resultado negativo da reaçäo em cadeia de polimerase. Aquelas amostras foram submetidas novamente a Amplicor individual e uma análise de "nested" reaçäo em cadeia da polimerase "in house". Foi mostrado que o sistema de pool de reaçäo em cadeia da polimerase, usando Amplicor HCV Roche, é viável e específico, mas incabível para a rotina de um banco de sangue devido a necessidade de "splitting" e retestagem de pools positivos enquanto as unidades de sangue correspondentes permanecem temporariamente bloqueadas. Além do mais, o método näo alcançou a sensibilidade desejada ("pools" contendo amostras positivas foram contabilizados como negativos), levando à conclusäo que a testagem individual de doaçöes é o objetivo final a ser alcançado.

Antígeno B adquirido: descriçäo de dois casos decorrentes de uso com anticorpos monoclonais derivados do clone ES4 / Acquired B Antigen: description of two cases due to monoclonal antibodies derived from ES4 clone

O fenômeno "B" adquirido consiste em uma modificaçäo do antígeno A pela açäo de enzimas bacterianas. Alguns reagentes monoclonais preparados a partir do clone ES4 säo conhecidos por detectar o antígeno "B" adquirido. A atividade deste antígeno é diminuída em meio de baixo pH. A correta interpretaçäo deste fenômeno é fundamental para evitarmos erros de tipagem sangüínea. O objetivo deste trabalho é a descriçäo de dois casos recentemente observados em nosso serviço. O primeiro refere-se a uma paciente de sexo feminino, 73 anos, com tumor de cólon e o segundo a uma paciente do sexo feminino, 63 anos, com Síndrome mielodisplásica e infecçäo urinária. As hemácias das pacientes foram analisadas contra dois soros anti-A, dois soros anti-B e dois soros anti-AB de procedências distintas e demonstraram resultados característicos ao grupo sanguíneo A, porém verificou-se reatividade com um dos soros anti-B monoclonais utilizados. Diante disto, as hemácias foram analisadas contra um painel de soros anti-B e nos casos reativos, o soro foi acidificado (pH=6,0) para confirmaçäo diagnóstica. Dos painéis de soros anti-B analisados, quatro soros apresentaram reatividade. Todos os soros perderam a reatividade ao serem acidificados. Dos seis soros anti-B reativos, cinco foram fabricados a partir do clone ES4. Portanto, concluímos tratar-se de dois casos do fenômeno "B" adquirido utilizando reagentes produzidos a partir do clone ES4, mostrando a importância da avaliaçäo dos reagentes utilizados na rotina em serviços hemoterápicos, bem como da avaliaçäo detalhada das propriedades, métodos e limitaçöes de cada reagente.

Is there a role for leukocyte depletion filters to remove Trypanosoma cruzi infection from donor blood?

First and third generation leukocyte filters were used to filter blood units inoculated with trypomastigote forms of Trypanosoma cruzi. After blood filtration an aliquot of preor post-filtered blood was infected in isogenic mice. Infection evolution was followed by microscopic parasite count, indirect immunofluorescence and histopathological examination. All the animals that received pre-filtered blood (n = 27) accquired infection, while 26 percent of the mice injected with post-filtered blood (n = 27) were apparently not infected. A trend for late onset and peak of the parasitaemia was also observed among infected animals that received post-filtered blood (p<0.05). Additionally, the apparently non-infected mice also tested negative for both indirect immunofluorescence and histopathological examination. The results of this study, though very preliminary, suggest that that leukocyte filters might help to improve the safety of blood with regard to Trypanosoma, cruzi transmission.

Sistema "top and bottom (opti-press)": uma nova alternativa para preparo de componentes sanguíneos pobres em leucócitos / \"Top and bottom (opti-press)\" system: a new way to preparation of leukocytes poor blood components

O alto número de leucócitos presentes em componentes sanguíneos tem causado diversos problemas técnicos e clínicos para a hemoterapia atual. O sistema "Top and Bottom" para preparo de plaquetas nos permite obter concentrado de glóbulos e plaquetas pobres em leucócitos a partir de uma doaçäo de sangue total. O sangue é centrifugado a 3560 g por 10 minutos, colocado no aparelho Opti-Press (marca registrada) para separaçäo dos glóbulos, plasma e "buffy-coat". Após liberaçäo da sorologia e tipagem, é realizado assepticamente o "pool" de mesmo ABO de 3 a 6 "buffy-coats". Este pool é centrifugado a 2280 g por 5 minutos para separaçäo do sobrenadante rico em plaquetas, que é transferido para bolsa PL-732 e estocado por 5 dias após coleta. Os resultados obtidos apresentaram uma remoçäo de 80 por cento de leucócitos no concentrado de glóbulos (6,4 + 4,1 x 10(8) leucócitos totais finais) e 85 por cento de reduçäo de leucócitos no concetrado plaquetário (0,2 + 0,2 x 10(8) leucócitos). A recuperaçäo plaquetária näo foi inferior ao encontrado no sistema tradicional (69 por cento x 70 por cento respectivamente). O volume plasmático obtido (264,0 + 25,6 mL) foi significantemente superior ao obtido pelo PRP (194,8 + 27,1 mL) (p < 0,05). Os valores obtidos no controle de qualidade durante estocagem dos "pools" de plaquetas foram considerados ideais para boa qualidade de preservaçäo. Apesar de alguns problemas, como perda de aproximadamente 25,0 mL de hemácias e aumento de custo operacional, pensamos que os produtos obtidos estäo mais concordantes com as reais necessidade dos pacientes.

Pesquisa de anti-HBc em doadores de sangue em Säo Paulo: deverá esse teste ser adotado pelo Brasil? / Anti-BHc research in blood donors in Säo Paulo: should this test be adopted in Brazil?

Objetivo do estudo: determinar a incidência de anticorpos contra o AgHBc (anti-HBc) no soro de doadores de sangue como método indireto de prevençäo de hepatite näo A-näo B pós-transfusional (HNANB-PT). Tipo de estudo: prospectivo, abrangendo toda a populaçäo de doadores de 1 de setembro a 31 de dezembro de 1989 (n = 2.773 doadores). Local: Hospital Sírio Libanês e 9 de Julho (Säo Paulo). Pacientes: total de 2.773 doadores, sendo 84% do sexo masculino e 16% do sexo feminino. Intervençöes: os testes foram executados por método ELISA competitivo. Medidas e resultados: no total geral, 10,2% dos doadores apresentavam anti-HBc repetidamente reativo, com maior incidência no sexo masculino (10,9% x 6,8% p < 0,05 ao X**2). Apenas 4,5% foram considerados borderline e 94,5% tiveram relaçäo absorçäo/cut-off < 0,9. Conclusöes: apesar da ausência de estudos prospectivos de HNANB-PT no país com correlaçäo de testes indiretos (anti-HBc), a alta incidência do anti-HBc em doadores permite a conclusäo de sua alta prevalência no Brasil. Embora os custos relacionados à doaçäo desse teste sejam elevados, sua indicaçäo em vários países, assim como a corrrelaçäo com testes mais específicos de primeira geraçäo (anti-HVC), permite a utilizaçäo do anti-HBc em centros hemoterápicos mais desenvolvidos no país